动物病毒性疾病疫苗和免疫

很多感染家畜和伴侣动物的传染性疾病都是由病毒性病原体所引起的。为确保动物生产达到最高标准的质量和福利，需要开发有效的工具，来预防或停止这些影响动物饲养的感染性疾病的传播。

免疫是目前可选择最佳策略之一，但现有的大多数疫苗都依赖于传统的疫苗技术（灭活或减毒疫苗），在某些特定情况下，出于安全考虑，这可能不是最佳选择，特别是在无疾病的国家，可能存在引入疾病的风险。所以，疫苗生产方式的优化是必需的，以使其更适应新一代的疫苗技术。

OIE需申报的病毒性疾病及感染的陆生/水生动物

免疫机制

免疫反应中的细胞协作。免疫后，特定的吞噬细胞将处理后的抗原递呈给天然B或T细胞，在形成一定的共刺激信号（源于PAMP和细胞性PRR的相互作用）后，细胞被激活。激活作用驱动淋巴细胞分泌可溶性介质和抗体，启动验证反应（A.Brun,）。

免疫促进特异性的诱导和免疫记忆。特异性疫苗抗原/刺激物活化的吞噬细胞激活天然T细胞，形成淋巴细胞的初步克隆扩增。遇到病原体（感染）所形成的效应和记忆细胞池会进行大规模的二级扩增（A.Brun,）。

疫苗技术

疫苗的第一种分类基于其所具有的免疫原性水平：灭活非感染性和活性衰减疫苗。抗病毒疫苗的两种主要类别可根据所使用的病毒的性质（活或死）或相关的抗原（完整或部分）进行分类，事实上，目前获批的所有抗病毒疫苗都可以分到这些类别中。

这种分类中，I型疫苗包括以灭活方法生产的疫苗，而II型疫苗为所有使用活性衰减病毒的疫苗，包括使用反向遗传法制备的疫苗。III型和IV疫苗包括只使用病原体组分或部分作为疫苗抗原的疫苗。所以，III型疫苗包括亚单位疫苗，如载体微/纳米颗粒和以真核或原核细胞通过重组技术生产的病毒样颗粒（VLP）疫苗，以及表达异源疫苗抗原的灭活重组载体。在该类别中，还包括核酸疫苗和基于多肽的疫苗。最后，IV型疫苗指经活病毒载体递送、编码并表达特定的经选择的异源抗原的疫苗。

显然，所有这些类型都可以进一步分类，如根据疫苗的剂型以及用于增强免疫反应的佐剂类型。减毒苗可包括毒力降低的天然病毒分离物或经连续传代获得的衰减病毒，以及通过反向遗传方法拯救的病毒。核酸疫苗可基于DNA质粒或自我复制的RNA分子，其由编码病毒复制子的DNA质粒启动。

对于每种技术，都有多种方法可用于生产或抗原表达、进一步修饰以及制剂，所以，可进行实验测试的潜在组合有很多种。选择哪种方式取决于在感染模型中获得的实验（临床前）数据。此外，疫苗的进一步分类还可基于提供免疫的主要类型——黏膜、系统、体液或细胞，以及给药方法——口腔、注射，或增强免疫组合。

I型疫苗技术

灭活抗病毒疫苗已有非常长的使用历史，其一般通过化学或物理方法，破坏病毒的复制能力。在众多化学方法中，最常使用甲醛和有机化合物，后者如环酯（β-丙内酯）或二乙烯亚胺（BEI）。其它交联剂也可用作灭活的选择，如戊二醛，但其使用不如甲醛广泛。

使用交联剂进行疫苗制备的两个主要挑战是：一、可能引起聚集，导致抗原表位的破坏或修饰，降低疫苗的免疫原性，通常需要2到3次的加强免疫，以维持足够且持续的保护性免疫水平；二是可能有不完全灭活的风险，比如部分（或未达到最佳）诱导的免疫与感染一起，通过诸如抗体依赖性增强（ADE）的机制，可能导致疾病加剧。此外，灭活疫苗的另一个问题是区分感染和免疫的动物，以免干扰监测诊断。

甲醛主要与蛋白质反应，而β-丙内酯（BPL）和二乙烯亚胺（BEI）主要修饰DNA或RNA，所以BPL在病毒灭活中可维持更高的免疫原性。但有报导显示，BPL可能也可以和某些氨基酸反应，包括半胱氨酸、蛋氨酸和组氨酸，蛋白质的特定修饰可能会影响BPL疫苗的免疫原性。类似的，BEI也可与蛋白质反应，这种化合物被广泛应用于口蹄疫病毒（FMDV）的灭活，以制备疫苗。

但不管怎样，灭活疫苗仍是疫苗生产的主导方法，对于人用和兽用疫苗均是如此，部分原因是疫苗制剂中佐剂（主要为铝盐）的效力可克服免疫性受限的主要问题。事实上，这种技术可通过其它灭活方法而优化，如使用过氧化氢或质子化合物，比如焦炭酸二乙酯（DEPC）。过氧化氢可灭活DNA和RNA病毒（如痘病毒、LCMV、WNV和YFV），对抗原损伤较低，从而降低了对免疫原性的影响。更有意思的是，这种方法可使疫苗既能诱导体液免疫（中和抗体），又能诱导细胞免疫反应，包括WNV和LCMV特异性CD8+细胞毒性T细胞。使用组氨酸质子化试剂，如DEPC，可抑制水泡口炎病毒（VSV）对小鼠的感染性和致病性。

尽管用于刺激免疫反应的不同技术都有了较大的发展，经典的灭活方法仍被广泛用于动物疫苗的生产，一部分原因是因为生产厂商需要仔细平衡其已有的传统生产工艺采用新技术所需的投入以及预期的收益。另一种传统灭活技术是使用物理方法，即暴露于不同的辐射源：热、电磁或离子。UV辐照是人用疫苗生产最常使用的方法。

II型疫苗技术

活性衰减病毒疫苗是最成功的疫苗形式之一，特别是考虑到免疫原性特性。复制能力使这种疫苗能更强地诱导天然反应，这是可显著影响获得性免疫反应结果的特性。多种兽用及伴侣动物疫苗都基于衰减病毒，这种类型的疫苗也用于人用。

减毒疫苗的一个共同特性是毒力因子的缺失，但同时维持免疫原性。减毒疫苗开发的传统方法是在异源细胞培养或啮齿动物、乳鼠、兔或山羊脑组织中进行病毒的一系列的传代或增殖，特别是用于兽用使用。在不同组织中的增殖通常以趋向性的变化而结束。例如，在脑组织中传代的嗜肝性病毒不能通过获得性神经毒力而在肝中复制。另一种不同的方法是使用诱变性化合物诱导突变，如核苷类似物。在低温条件下生长的温度敏感性突变体不能在宿主体内的正常温度条件下生长。

减毒疫苗相比灭活或亚单位疫苗的主要优势是更宽泛的表位递呈，显然，在受感染宿主细胞中，病毒复制的结果是更多的蛋白表达（感染细胞蛋白片段会通过MHC-I递呈）。引起的免疫反应也与感染相似，包括触发天然免疫反应，以及体液和/或细胞反应。更重要的是，兽用疫苗市场通常可负担得起该类型疫苗的生产成本。

另一方面，减毒疫苗的潜在缺点是基因性的不稳定，导致的问题包括毒力的恢复或复制表型的丢失、与免疫抑制个体相关的问题、以及某些减毒疫苗用于怀孕动物时的有害作用。这通常会发生在使用灭活工艺没有完全控制或了解的方法所获得的疫苗，即在组织培养中系列增殖。此外，对于可感染多个物种的疾病的疫苗，如对特定的反刍宿主安全的疫苗，可能对猪并不安全。一般认为，灭活疫苗的安全问题比减毒疫苗少。

对病原体生物学、免疫学和分子生物学的了解，有助于更加合理的疫苗设计，开发衰减类型疫苗的替代产品。特别是对于RNA病毒，反向遗传系统的形成可允许开发安全性更高的新型衰减疫苗，因其可从克隆的病毒基因组和转录组中“拯救”完整感染性病毒。对于DNA病毒，确定毒力和/或免疫调节基因，可允许通过同源重组技术进行敲除。

在大多数情况下，对基因组的修饰，可向这些动物疫苗引入重要的特性，以从免疫动物区分感染动物，这在执行监测诊断时特别重要。

III型疫苗技术

病原体经鉴定之后，可从完整病原体分离保护性抗原片段或组分，或在异源系统中通过克隆和表达进行生产，包括细菌、酵母、植物、真核细胞。亚单位微粒和核酸疫苗也可包括在这一类型中。使用这种方法产生的免疫反应的特异性被最大化，而免疫反应的量级较衰减疫苗低。所以，需要考虑使用免疫佐剂、靶向策略或初免加强方案，以增强免疫反应。

亚单位疫苗相比传统减毒疫苗有多种优势，特别是考虑到安全性和生产。亚单位疫苗生产最常使用的系统是基于细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞的系统。最近，也开始出现了基于非发酵方法的其它系统，例如开发了活的有机体，特别是植物或昆虫。在植物中，开发了两种主要的替代物，通过植物病毒或细菌载体的基因修饰或瞬时表达抗原。在活昆虫中（鳞翅目），重组杆状病毒可用于感染昆虫幼虫，形成转基因家蚕。

亚单位疫苗的一个特殊点是可以通过共表达病毒子的衣壳蛋白组成，形成病毒样颗粒（VLP），但不含核糖核蛋白。与病毒衣壳一样，VLP由几何排列的蛋白质组成，形成重复结构，可溶性抗体和/或B细胞受体可高亲和地与其相互作用。所以这些结构是T细胞非依赖性响应的良好诱导因子。

此外，VLP可被APC内化和处理，诱导Th和CTL反应，所有有潜力刺激比蛋白质亚单位的单体形式更宽泛的免疫反应。VLP的另一个优势，是其可使用多种不同的表达系统生产（杆状病毒、痘病毒、甲病毒复制子、植物、沙门氏菌、E.Coli、酵母等），甚至可经基因工程处理，以嵌合-VLP的形式，表达外源表位或免疫刺激分子，或通过免疫调节子的共价交联（线性或环状多肽、半抗原、聚糖）。

另一种更加特殊的方式是在单室脂质体内进行病毒囊膜的重构，成为病毒颗粒或病毒体。这种合成的结构也可以用免疫刺激偶联物、甚至异源分子（如DNA、siRNA、抗体片断）补充。不过，从兽用疫苗角度来看，VLP亚单位疫苗及其衍生物可能需要更高的生产成本，这会妨碍其成为更广为接受的疫苗生产技术。

与使用全蛋白作为抗原不同，鉴定的免疫原性表位可用于设计合成性多肽，以更特异地诱导免疫反应。已知的B和T细胞表位和组成可包含在多肽疫苗的设计当中。相比亚单位蛋白疫苗，多肽的一个优势是更简单的生产、储存和物流方式，以及可更灵活地进行修饰或突变（用于快速变异的病毒）。

尽管有这些优势，多肽免疫目前还没有成为一种常规的方法，因为这需要对在宿主物种内保护性免疫反应有更深入的了解，而且相比全蛋白，多肽的天然免疫原性更低。当然，免疫原性可通过多聚化策略进行增强，或者使用共价粘附多肽的微/纳米颗粒递送系统，以促进与免疫细胞受体的相互反应。

年开发了第一个抗流感的DNA疫苗。DNA疫苗通常通过肌肉或皮下注射。细胞间隙内的树突状细胞会摄取可溶性抗原，或摄取被疫苗杀死的细胞，甚至可被直接转染。另一方面，蛋白质的细胞溶质表达使其可在肌肉或树突细胞内进行MHC-I处理。MHC上调是未甲基化CpG模体与TLR-9受体衔接所形成的天然免疫刺激的一个结果。

DNA疫苗的主要优势设计和生产简单，可区分免疫和感染的动物（DIVA），抗原被天然处理，模拟病毒复制所诱导的免疫反应，从而刺激细胞和体液免疫反应的发展。最后，与其它疫苗策略一起，DNA允许结合多种抗原、靶向信号或免疫调节分子（细胞因子和趋化因子），以提高引起的免疫反应。DNA免疫目前在小鼠模型中获得了成功。

但是，对抗家畜病毒疾病的大动物实验性DNA免疫仍需进一步的优化，以达到更强的免疫反应，免疫所需的较高质粒数量可能是一个严重的缺点，使用更强的启动子、基于质粒的复制子（甲病毒）、提高质粒摄入效率或通过与免疫刺激分子的共递送等方法可部分解决该问题。不管怎样，对于疫苗的合理设计来说，这仍是一种非常有吸引力的方法，简化了疫苗生产，并可以组合疫苗的方法进行使用。

IV型疫苗技术

重组病毒载体是疫苗设计和实验免疫方法的一种极重要的平台。事实上，任何具有感染性而无致病性的病毒都可用于表达外源基因，提供重组整合和表达的系统。

不同的RNA病毒可使用反向遗传系统进行衰减来完成，或使用同源重组技术处理DNA病毒。在用于递送疫苗抗原的DNA病毒中，痘病毒、疱疹病毒、腺病毒和杆状病毒在实验性疫苗试验中使用最为广泛。DNA病毒相比RNA病毒的最主要的优势是DNA基因组更高的稳定性、更多的插入位点以及BAC-NDA克隆的可用性，并可在传统的实验室中进行重组病毒的拯救。其它特点还包括细胞质复制（除疱疹病毒外）以及诱导长时间的体液和细胞免疫反应，而重点是更强的CD8-T细胞激活，其由衰减的痘病毒和腺病毒感染介导。

在RNA病毒这边，来自不同家族的多种病毒被用作外源基因载体：甲病毒、布尼亚病毒、冠状病毒、黄病毒、副粘病毒、逆转录病毒、棒状病毒。通过反向遗传技术，有可能从其基因组的拷贝中拯救感染性病毒。

副黏病毒是体液和细胞免疫反应的加强诱导因素，用作衰减疫苗时，可形成完整的长时间保护，其允许相关家族成员之间核蛋白或囊膜糖蛋白的交互，形成嵌合病毒，以作为二价标记衰减疫苗使用。此外，其可容纳额外的基因信息，以表达外源抗原，在细胞培养的增殖过程中维持稳定，所以，也可用于针对病原性副黏病毒和其它感染性病毒的免疫。

衰减的棒状病毒可通过操作病毒糖蛋白和磷酸化蛋白和/或基因组次序重排而获得，提供上述相似的特性，从而用作外源基因的递送载体，包括诱导天然和获得性免疫反应。这种载体类型的另一个优势是在人体或动物群落中没有血清阳性反应。

复制缺陷型甲病毒也可经修饰表达外源抗原，在肿瘤和基因治疗中，用作疫苗。甲病毒一个有趣的特性是，其可诱导黏膜保护性免疫反应。

对于某些布尼亚病毒，对其体外生产非基本的毒力基因的鉴定，可允许替换成报告基因或其它病毒抗原。作为衰减病毒，其在宿主体内有能力维持有限的复制，可启动针对转基因的天然免疫反应。

所有这些案例都显示出，在设计衰减载体疫苗时可选择的策略数量，以及设计可同时诱导针对多种病毒病原体保护的标记疫苗的可能性（多价疫苗）。

小编出于交流目的编译此文，由于水平有限，不当之处，敬请谅解。完整内容，请参看原文。

原文：A.Brun,VaccineTechologiesforVeterinaryViralDiseases:MethodsandProtocol,MethodsandMolecularBiologyVol.,DOI10./-1---1_1.

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