LY6E破坏冠状病毒融合并对病毒性疾病进

研究背景

人畜共患病冠状病毒（CoVs）是对全球健康的重大威胁，最近出现的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）就是例证。宿主对CoV的免疫反应是复杂的，部分是通过抗病毒干扰素调节的。然而，干扰素刺激的抑制CoV的基因产物并没有很好的特异性。这篇文章作者主要研究的是LY6E对CoV的作用机制，作者通过研究发现干扰素诱导的淋巴细胞抗原6复合物，即LY6E能有效地抑制多种冠状病毒的细胞感染，包括SARS-CoV、SARS-CoV-2和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）。机制研究表明，LY6E通过干扰S蛋白介导的膜融合抑制CoV进入细胞。还发现造血细胞中缺乏Ly6e的小鼠对鼠类COV高度敏感，Ly6e基因敲除小鼠病毒发病机制的恶化伴随着肝、脾免疫细胞的丢失和抗病毒基因途径的减少和Ly6e直接保护原代B细胞和树突状细胞免受小鼠CoV感染，这些发现证明LY6E是一种控制CoV感染和发病的重要抗病毒免疫效应物。作者的发现可以促进我们对免疫介导的体外和体内CoV控制的了解，帮助我们制定策略来对抗新出现的CoV感染。

结果

1.LY6E破坏冠状病毒融合

（1）LY6E能有效地抑制多种冠状病毒的细胞感染

作者首先筛选了他们出版的人类肝癌细胞中超过种人ISG-cDNAs文库，以检测针对地方性人CoVE（HCoV-E）的抗病毒活性,发现ISG淋巴细胞抗原6复合物，即LYE6显著抑制HCoV-E感染（图1a-b）。为了验证以上结果，作者通过细胞系外表达外源性LY6E，发现除HCoV-E（图1c）外，可以显著抑制HCoV-OC43、MERS-CoV、SARS-CoV和新近出现的SARS-CoV-2的感染（图1d-g）。LY6E的抗病毒作用不仅限于人类CoV，也可以阻断小鼠对MHV的感染（图1h）。考虑到SARS-CoV和MERS-CoV的人畜共患病来源，都被怀疑来自蝙蝠，作者接下来测试了LY6E同源物的抗病毒潜力，发现人类、恒河猴、小鼠、蝙蝠和骆驼的LY6E都可以抑制HCoV-E。同时作者也通过CRISPR-Cas9基因编辑来清除人肺腺癌细胞中LY6E的表达（图1i）来测试内源性LY6E在控制CoV感染中的作用，发现LYE6基因敲除（KO）细胞对HCoV-E更敏感（图1j），重组的抗CRISPR的LYE6突变（crly6e）恢复了KO细胞的抗病毒活性（图1k-l）。LY6E是GPI锚定蛋白的LY6/UPAR家族成员，参与多种细胞过程，为了证明LY6E抑制CoV的特异性，作者通过异位表达LY6E蛋白，并感染了HCOV-E，发现只有LY6E抑制了CoV感染，说明了LY6家族中的LY6E抑制CoV是特异性的。

图1

（2）LY6E通过干扰S蛋白介导的膜融合抑制CoV进入细胞

接下来，作者想知道LY6E到底通过什么机制来抑制CoV的，所以作者研究了LY6E对病毒复制周期特定步骤的影响。首先，测试了LY6E是否限制HCoV-E在细胞表面的附着，发现没有影响后，作者使用了一个水泡口炎病毒（VSV）伪粒子（pp）系统，该系统含有CoV-spike（S）蛋白，发现LY6E显著抑制了HCoV-E（图2a）、MERS-CoV（图2b）、SARS-CoV（图2c）和SARS-CoV-2（图2d）中S蛋白介导的VSVpp进入，即LY6E可以限制病毒进入。为了检测LY6E是否干扰病毒和细胞膜的融合，作者进行了合胞体形成分析，发现LY6E能有效抑制CoVS蛋白介导的合胞体形成（图2e-f）。为了确定LY6E是否影响蛋白质表达或成熟，作者还进行了异源合胞体形成分析，发现LY6E抑制蛋白质介导的融合，而不是S蛋白的表达或成熟。由于膜融合可以在不形成合胞体的情况下进行，作者还进行了定量融合试验，发现LY6E阻断了病毒与细胞膜的融合(图2h)。所以我们可以通过研究病毒的复制周期的步骤来确定LY6E是如何抑制CoV的，作者通过这些研究发现LY6E特异性地抑制了CoVS蛋白介导的膜融合。

图2

2.LY6E是一种控制CoV感染和发病的重要抗病毒免疫效应物

（1）造血细胞中缺乏Ly6e的小鼠对鼠类COV高度敏感

作者首先思考了LY6E对于控制体内CoV感染是否是必需的，考虑到MHV发病机制受性别影响，所以作者在雄性和雌性小鼠中进行了独立实验。到第6天，两种性别的Ly6eΔHSC小鼠迅速死于MHV感染（图3a-b）。为了检查感染小鼠中的病毒发病机理和免疫病理学，用相同高剂量的MHV感染Ly6efl/fl和Ly6eΔHSC小鼠并在感染后3或5天实施安乐死。在两个时间点，通过血清ALT测量，雌性Ly6eΔHSC小鼠表现出显着更高水平的肝损伤，而在雄性小鼠中未观察到差异（图3c，i）。然而，肝脏病毒负荷在两种性别中没有差异（图d，j），可能是由于在该高剂量下组织饱和。接着也用低剂量（5PFU）的MHV进行实验，发现雌性和雄性Ly6eΔHSC小鼠的脾病毒负荷均升高（图3e，k），而且在感染后3天，肝坏死没有差异，但在雌性但不是雄性Ly6eΔHSC小鼠中炎症中度减少（图3f-h）。而在中等病毒剂量（5×PFU）也进一步证实Ly6eΔHSC小鼠的肝损伤，其导致明显的脆性，苍白和坏死病灶。这些实验表明造血细胞中的Ly6e对于控制鼠CoV感染是重要的。

图3

（2）Ly6e基因敲除小鼠病毒发病机制的恶化伴随着肝、脾免疫细胞的丢失和抗病毒基因途径的减少，Ly6e可以直接保护原代B细胞和树突状细胞免受小鼠CoV感染

作者接下来使用转录组学方法来评估Ly6e敲除对感染后3天和5天注射PBS或高剂量MHV的雌性Ly6efl/fl和Ly6eΔHSC小鼠的肝脏和脾脏中基因表达的影响，发现在受感染的组织中，造血细胞中Ly6e的丧失与与组织损伤相关的途径中的差异基因表达相关，例如肝特异性代谢基因，血管生成，伤口愈合和对病毒的免疫应答（图3a-c）。作者还观察到感染的Ly6eΔHSC小鼠中与I型IFN应答，炎症，抗原呈递和B细胞相关的基因的显著丢失（图3d-e）。

通过组织病理学（图3h，n）和转录组数据（图4a-e），作者确定了Ly6e的丧失是如何影响感染期间的免疫细胞数量。即在注射PBS或中等剂量的MHV后5天，从Ly6eΔHSC和Ly6efl/fl小鼠定量不同免疫细胞亚群的绝对数量。发现无论性别如何，感染的Ly6eΔHSC小鼠的肝脏和脾脏中的多种细胞类型都被耗尽（图4f-g），来自感染的Ly6eΔHSC小鼠的肝脏中B细胞显着减少，并且在感染的Ly6eΔHSC小鼠中，肝CD4+T细胞，NK细胞，树突细胞（DC），巨噬细胞和嗜中性粒细胞也被耗尽，而CD8+T细胞未改变（图4f）。除CD4+和CD8+T细胞外，感染的Ly6eΔHSC小鼠的所有脾免疫细胞亚群均减少（图4g）。为了确定MHV感染的Ly6eΔHSC小鼠中免疫细胞的丧失是否与增加的感染敏感性相关，作者评估了从Ly6eΔHSC，Ly6efl/fl和Ifnar-/-小鼠培养的脾细胞中的MHV感染，发现Ly6efl/fl脾细胞培养物中，MHV感染的是巨噬细胞，中性粒细胞，DC和B细胞，但不是CD4+或CD8+T细胞（图4h），还发现与Ly6efl/fl或Ifnar-/-小鼠的B细胞相比，雄性和雌性Ly6eΔHSC小鼠的B细胞对MHV感染高度敏感，雌性Ly6eΔHSC小鼠的DC也更易感染MHV，而且没有其他类型的细胞对MHV感染表现出强烈的Ly6e敏感性。

讨论与总结

作者证明了Ly6e在免疫细胞介导的CoV感染控制中的重要作用，较高的病毒负荷和较低的肝脏炎症表明MHV感染的雌性Ly6eΔHSC小鼠的肝损伤可能是由于病毒发病机制超过免疫系统控制感染的能力。作者观察到MHV诱导的三类细胞损失：1）对病毒不依赖的细胞（CD4+T细胞），2）对MHV依赖但不表现出Ly6eKO依赖性感染的细胞（NK细胞，巨噬细胞和中性粒细胞），和3）对MHV呈Ly6eKO依赖性的细胞（B细胞和DC）。第三组细胞能够将抗原呈递给CD4+T细胞，因此，在不存在Ly6e的情况下，B细胞或DC的不受限制的MHV感染可能损害T细胞启动，从减少NK细胞，巨噬细胞和嗜中性粒细胞的募集和活化。

总之，作者将LY6E鉴定为泛CoV限制因子，其限制CoV进入并保护宿主免于严重的病毒性疾病。作者的数据清楚地展示了LY6E在冠状病毒感染期间的作用，并建立了保护宿主免疫细胞区室的新功能。确定LY6E如何抑制CoVS蛋白介导的膜融合的精确分子机制将促进我们对针对这些重要人类病原体的细胞抗病毒防御的理解，抗病毒膜融合抑制剂已成功用于治疗HIV-1感染。模仿LY6E作用机制的治疗方法可以为新出现的CoV感染提供第一道防线。此外，阐明哪些表达Ly6e的免疫细胞可以保护小鼠免受MHV感染，这将为深入了解不同细胞室中的个体抗病毒效应器如何调节病毒发病机制提供新的视角。

读者思考

本文首先从外源性和内源性两个方面证明LY6E能有效地抑制多种冠状病毒的细胞感染，也证明了其作用是特异性的抑制，然后作者通过研究病毒的复制周期的步骤确定了LY6E抑制了CoVS蛋白介导的膜融合，最后作者确定了LY6E是一种控制CoV感染和发病的重要抗病毒免疫效应物。在我们进行相关试验时，本文可以为新出现的CoV感染提供第一道防线，值得我们借鉴，同时我们也需要考虑这些研究是否具有普适性，具体问题需要我们具体分析。

本文LY6Eimpairscoronavirusfusionandconfersimmunecontrolofviraldisease，于年3月5日发表在bioRxiv上。StephaniePfaender为第一作者，CharlesM.Rice,JohnW.Schoggins,andVolkerThie为共同通讯作者，LaboratoryofVirologyandInfectiousDisease,TheRockefellerUniversity,NewYork,NY,USA和InstituteofVirologyandImmunology,BernandMittelha?usern,Switzerland；为共通讯单位。